微纳米生物粒子介电常数测试平台关键技术的研究

摘要

在研究分析国外生物粒子介电常数测量的理论模型，包括有效偶极矩理论、粒子等效模型、电动旋转介电泳及行波介电泳模型的基础上，建立了基于介电泳技术的生物粒子介电常数的自动测量平台，并对建立测试平台所涉及的相关理论模型、微电极组设计及仿真、粒子角速度检测等关键技术进行了研究。

本研究设计了一种电动旋转介电泳和行波介电泳结合的微电极组，可以操纵粒子使之运动到合适的区域进行电旋转测量。借助Matlab、Comsol Multiphysics等软件，通过对行波电场的计算和仿真，分析了粒子的受力和运动情况；通过对旋转电场的仿真求解，分析了粒子在电极腔中所受转矩和介电泳力的分布情况。研究结果表明：在电极腔中心区域的半径为100µm的圆形区域为最佳区域，在这个区域中转矩的变化基本在5%以内，介电泳力很小，基本解决了测试过程中影响粒子测量精度的迁移运动问题，降低了测试误差,并且螺旋线电极组可以在一定频段范围内实现粒子的集中和分散。粒子在输运过程中距离螺旋电极表面的高度应大于25um，以保证粒子行进的稳定性。

另一方面，融合机器视觉技术和概率统计的算法，实现了对单个和多个粒子进行测量，且对粒子的形状没有特殊要求。测试平台具有较高的准确性和运行效率，同时具有良好的普遍适用性和鲁棒性。

关键词：等效偶极矩；介电常数；电动旋转介电泳；行波介电泳；机器视觉技术

第一章 绪论

1.1引言

随着微电子技术的高速发展和生物研究的不断深入，微电子制造和小型化方面的许多先进技术逐渐应用于生物研究领域。近十多年间，微流控器件正逐渐代替大而昂贵的仪器。微流控器件的目标是将小分析实验室集成在芯片上，完成鉴别、稳定、分离、纯化细胞、生物分子及霉素等其他生化物质。和传统仪器相比，集成微流控器件将流体、电子、机械部件及化学反应都集成到了单个芯片上，灵敏性和效率更高，而且成本低的多，很经济^[1-3]。比如芯片实验室（Lab-on-a-chip），它能够以更高的精度完成传统的实验室所能完成的测试，并且所需的试剂更少，成本更低，性能可靠。芯片实验室的典型尺寸为5cm²左右，一般包括NanoChip^R (Nanogen, San Diego, CA, USA),LabChip^R (Caliper Technologies Inc., Mountain View,CA, USA) 以及GeneChip^R (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)等^[4].由于这种微型化的设备体积远远小于传统实验室的设备系统，处理过程更加迅速。比如，有限反应扩散在很小的体积比在很大的体积内所需的时间小的多，因为在微小体积内，反应物所要迁移的距离小了很多。当在芯片实验室中加入自动控制技术时，小型化的系统就有相当多的优点。此外，可以将许多芯片实验室并行工作，这样效率会大大增加。这种技术具有非常良好的市场前景，比如在医疗、医药行业，以及公共卫生方面的病原体检测分析方面潜力很大。

介电泳是微流控器件的一项使能技术。它利用粒子间的介电属性之间的差异操纵和鉴别悬浮在流体介质中的粒子。在非均匀电场中，极化作用粒子可被捕捉或在高强度电场区和低强度电场区之间移动。通过改变激励电场的频率，作用于粒子的介电泳力的幅值和相位可以控制。介电泳成功的应用于粒子的分离、输运、捕捉、分类。

其中，电动旋转介电泳（Electrorotation Dielectrophoresis，简记为ER-DEP或ROT-DEP）是一种简捷、非入侵的通用分析技术（下文简称为电旋转），适用于各种类型的粒子，并且能够应用于芯片实验室（Lab-on-a-chip）。它是一种使悬浮在旋转电场中的粒子旋转的技术。粒子受电场作用会产生电偶极矩，而偶极矩的旋转速率和方向并不是和旋转电场同步的。由于旋转电场和诱导偶极矩之间的相互作用，于是粒子受到转矩作用而旋转起来。由于诱导偶极的特性和频率有关，所以对电旋转角速度（它是频率的函数）的测量可以确定粒子的介电特性。它作为芯片实验室中的一项技术，具有重要意义。

行波介电泳（Traveling-Wave Dielectrophoresis，简记 tw-DEP）可以看作将电旋转介电泳“展开”成直线，同样是在每个电极组（n个电极）上施加n个交流信号（n≥3），相邻交流信号之间相位差相同，电极组周期阵列排布。经历行波介电泳的粒子可以沿电极组行进，就像沿着轨道行进一样。这也是行波介电泳名称的来源。行波介电泳在介电泳芯片中占有重要地位，它可以完成满足许多对粒子的操纵要求，本研究中的介电泳测试芯片在测试过程中涉及对粒子的操纵，因此也用到行波介电泳技术。

此外，生物粒子的介电泳频谱，反映了粒子本身的许多属性，这对粒子特征的检测分析具有十分重要的作用。表征介质在外电场作用下极化程度的物理量叫介电常数，其英文为permittivity或dielectric constant，介电常数又称电容率。一般情况下，微粒子的介电常数会影响它的介电泳频谱。在交变电场作用下，粒子的介电常数是复数，虚数部分反映了损耗。由生物粒子形态及组成所决定的介电响应是生物粒子的一个重要特征，该特征可作为标定生物粒子类型的“指纹”^[5]。这种生物粒子指纹，也可用介电常数来表示。因此，生物粒子介电常数的获取是研究生物粒子介电模型、介电响应以及用于识别及分离特定生物粒子的介电显形的基础和前提，其地位相当重要，因此生物粒子的介电参数（主要是介电常数）的测量也成为现今工程领域的热点。

1.2研究历史背景及现状

1.2.1历史背景

非均匀交流电场产生的力可用来移动极化的微粒子—-例如悬浮在液体介质中的细胞、鉴别粒子等，旋转电场可以诱导这些粒子旋转。这种非接触式的操纵悬浮的粒子的能力在uTAS技术中很有潜力。用于粒子操纵和控制的非均匀电场由印制于基底上的微电极产生，电极的制造技术来源于MEMS（micro-electro-mechanical systems）技术。从简单的平面几何形状到复杂的三维设计，各种各样的电极结构当前都处于研究之中。生物工艺领域的各种各样的方案的意义深远，例如，细胞、细胞的组成成分以及人造标记微粒（带有生化标签）可利用1到100um量级尺度的微电极进行收集、分离、集聚、运输等。此外，这些力还可以操纵尺度比细胞小几个量级的DNA分子^[6]。

80年代，Arnold， Lertes及G Fuhr等^{[7, 8]}阐述了物体电旋转，证实了旋转电场可以诱导生物细胞实现可控的旋转运动，并且细胞的旋转速率和方向并不和旋转电场同步，并进行了相关试验并将结果与叶肉原生质体和文献中的相关数据作了比较。90年代初，R Hölzel等人^[9] 测出了Saccharomyces cerevisiae strain R XI这种活酵母细胞的细胞质、细胞壁和细胞膜的电导率分别是5.5mS/cm; 0.1~0.5mS/cm ;0.25nS~4.5mS/cm.这只是较为粗略的测量。对于亚微米粒子，比如乳胶球体和病毒（烟草花叶病毒和单纯疱疹病毒）也可用介电泳操纵以及测量其属性^[10]，只是随着粒子尺度的减小，微电极尺度也要减小^[11]，微电极阵列可利用直接写入式电子束平板印刷工艺制造。2001年，M Kriegmaier等人^[12]利用两种互补的交流动电技术：electrorotation（ER）和electroorientation（EO）测量了杆状裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe的介电属性，微电极的应用允许ER和EO测量适用于宽电场频率范围和宽介质电导率范围。由于S. pombe的分层结构，其出现了三个ER峰值以及两个不同的方向：例如,平行或垂直与激励电场的方向。热处理和酶原生质体隔离显著改变了裂殖酵母交流动电性质。ER和EO理论模型的应用得出了S. pombe的主要结构参数（cell wall, plasma membrane and cytosol）。酵母细胞的介电特性在生物工程和生物医学方面具有重大影响，因为电场脉冲技术（电穿孔和细胞监视）广泛用于具有经济重要性的转基因变种的生产。M Kriegmaier等人的研究表明：ER和EO的组合测量可作为一项分析酵母在各种应力环境下结构和生理变化的诊断工具。后来，C Dalton^[4]将这种技术应用于三类分开的原生寄生虫的传播生命周期进程:Cryptosporidium, Giardia和 Cyclospora以及一种线性蛔虫,并描述了每种对公共健康重要性，最后利用电旋转确定了individual G. intestinalis cysts, Cryptosporidium parvum 及 Cyclospora cayetanensis oocysts的活性, Cyclospora cayetanensis oocysts的孢子形成情况也被确定，就像 A. suum ova.的受精阶段.此研究的意义和影响在于:电旋转是一个简单,非入侵的分析技术,并且适用的粒子类型范围广泛,而且可以集成到芯片实验室设备中。另外，除了电旋转以外，行波介电泳也被许多研究小组研究，行波介电泳的使用比较灵活，电极组的形状及结构也各不相同^[13-15]。2004年，E G Cen^[16]设计的系统第一次在单个集成芯片（3×6 mm）上集成了三种互补的技术（DEP、TWD、ROT）。芯片利用了制作于硅基底上的微电极阵列，以利于各种控制操纵、测量、特征化哺乳动物细胞的非均匀电场的综合。其对一种人体恶性细胞（Daudi and NCI-H929，直径十几微米左右）的研究表明了在提供一个完全可设计微系统方面此系统的潜力和通用性。

电旋转适合应用于确定单细胞情况下的细胞的介电属性.然而电旋转严重的限制在于需要乏味的人工测量,于是G D Gasperis等人^[17]提出一种新的时实基于PC的机器视觉算法和硬件设备来获取细胞旋转运动并对频谱进行分析.此系统包括计算机控制的正交数字正弦信号发生器,能在5min之内测出1k--200MHz范围内的频谱,每十倍频程取4个测试点.利用光钳来辅助选择和定位细胞以使系统的灵活性和精度最大化.本系统的性能根据鲁棒性、精度、及关于人工测量的线性度来评定。本系统广泛应用于各种哺乳动物细胞形态和光学外观。细胞膜电容值与人工测量值差异在10%以内。本文中也谈到:不使用光钳（也称光镊夹）时,精度下降很小，一般仍能满足实验要求。这对降低实验成本和设备复杂性具有重要意义。

电旋转测试的实时性的意义绝不仅仅在于减轻人员的工作量，它体现在可以实时测试细胞发生生化反应过程中的状态，比如Hölzel^[18]测试了酵母细胞在抗生制霉菌素作用下的细胞膜和细胞质的变化，每3min测一次，有20条电旋转频谱，范围：1K－1GHz，制霉菌素作用的75min比7min时的酵母细胞膜通透性增加而细胞质电导率减小。

一般情况下，对电旋转实验中的旋转电场进行分析时，并未考虑磁场和热冲击的影响，事实上 ，磁场的影响确实可以忽略不计，热冲击效果存在，但有时也可以忽略。 Zhou等人^[19]应用电旋转频谱的计算机辅助自动成像技术探究了他人报道的针对酵母细胞的热冲击和低频EM场的生物影响。尽管观察到了热冲击效果，但是将细胞暴露于50Hz、8和80微特的场之后并未探测到电旋转行为的变化。尽管这并不能排除细胞被磁场影响的可能性，但是这确实限定了可能的发生在细胞壁和细胞膜的物理化学变化的数量。另外，对于电旋转的温度影响因素，D Mietchen等^[20]第一次定量陈述了电旋转的温度依赖性。生理范围内的温度变化对电旋转频谱的形状的影响不显著，但所有的频谱特征点（包括电场频率和旋转的振幅）都移位。D Mietchen等人开发了一种自主探测温度的装置来验证理论，它基于称为MOSPAD的针孔技术，自动化程度高，信号分析算法更加健壮，而且用video-RAM中的适应性虚拟掩模代替了光学路径中的实体。此研究描述了细胞内和细胞表面温度的物理生理效果具有可区分差异时的条件。

在电旋转实验中，分析转矩和力在电极腔中的变化规律是相当重要的，这是整个测试平台的关键问题，Hughes及Maswiwat等人在一定程度上确定了电旋转实验优化的条件，从一些特定角度评估了各种电极形状的优缺点^[21-23]。一般情况下，离电极腔中心越远，电场偏振（field polarization）程度越大，即偏心率离中心的距离的增大而增大。另一方面，相邻电极间距离应大，以避免电场热效应并使介电泳粒子收集程度最小。

1.2.2现状与存在问题分析

综合分析上述研究历史和现状发现，尽管取得了一定的研究成果，但许多研究人员只是运用电旋转技术测试一些生物粒子的介电特性随激励电场频率的变化情况或各种粒子的介电频谱之间的差异^{[4, 12, 18, 19, 24]}；并且很多情况下特定种类粒子的介电参数（如复合介电常数）并不能准确给出，其原因在于在这些研究中对电旋转腔中的粒子的受力和运动的分布情况并未做分析或仅为粗略分析，因此只能给出相对变化，而没有给出绝对的介电参数值。测量生物粒子介电常数的鲁棒性和准确性等方面存在一定的问题^{[17-20, 22, 25]}，特别是当粒子在旋转过程中改变位置的时候，对粒子在电极腔中受力状况和运动方式的分布规律以及粒子迁移造成的角速度检测误差方面的研究目前很少涉及。而本文的研究将会弥补这些方面的不足。

此外，由研究现状知，有些研究者所用的测试芯片在粒子的输运或操纵方面不完善，有的运用光镊夹来定位粒子进而进行介电属性的测试^{[17, 20]}，但这样不经济且并非必要；有的将几种介电泳技术组合起来使用^{[16, 26]}，但并没有很好的考虑其操作方便性且结构较简单，未进行优化；有的文献中虽然介绍了一些可以较好的输运粒子的微电极组结构^{[15, 27, 28]}，但并未将其应用到生物粒子介电常数测试过程中，也没有研究多种介电泳电极组之间的结合方式的设计问题 。因此，本文针对上述问题，设计了一种新型的介电泳测试芯片，基本解决了上述问题。

1.3本文研究目的和主要研究内容

1.3.1研究目的

鉴于上述的研究现状及存在的问题，本文的目的是：研究纳米生物粒子介电常数测试的关键技术，设计出一种新型的介电泳测试芯片，使其可操作性强并且具有较高的稳定性和可靠性，并在此基础上建立测试平台，并且通过理论分析及仿真分析提出实用、细致的测试方案，解决测试过程中影响测量精度的粒子迁移运动和受力状况改变等当前该领域中存在的问题，尽可能使测试具有较高的精度。1.3.2主要研究内容

本文的研究内容包括：理论模型与分析、介电泳测试芯片的设计、仿真分析以及自动测量平台的系统构建。本文主要完成的工作如下：

图1- 1主要研究内容及相互关系

• 理论模型与分析

通过研究基本理论，包括生物粒子的理论模型、介电泳对粒子的作用力的理论模型，得出介电常数测试中所需的理论表达式。通过对理论的分析，总结出一些对后续的微电极组设计、仿真具有指导作用的结论。

• 介电泳测试芯片设计

针对生物粒子介电常数的测量，设计一种介电泳测试芯片（主要指微电极组），适当考虑各种电极形状，并作一定的比较分析，同时还要考虑测试中对粒子操纵的便利性，以使得测试过程中测试芯片可以满足对粒子的操纵要求。

• 仿真与分析

对介电泳测试芯片上微电极组形成的电场分布情况及粒子的受力状况进行数值仿真分析，论证了所设计的微电极组的可行性，并对粒子可能的运动状态作分析，研究影响测量精度的相关因素，并得出相关结论。仿真的结果也在一定程度上验证了理论模型的准确性。

• 自动测量平台的系统构建

在前面设计、仿真的基础之上，建立基于机器视觉技术的自动测量系统，能够基本实现准确性和实时性的协调性问题，尽可能的做到适用范围广泛并具有较好的鲁棒性。测试系统中关键的检测算法具有良好的可扩展性。